Pemeriksaan Fisik

Pemeriksaan fisik yang dapat ditemukan pada pasien hemoglobinopati antara lain tanda-tanda anemia seperti konjungtiva anemis, pucat hipersplenisme, gagal jantung, jaundice dan tanda komplikasi penyakit seperti rodent face yang ditemukan pada pasien dengan thalassemia beta mayor.[3,12]

Diagnosis Banding

Diagnosis banding hemoglobinopati antara lain:

Thalassemia Beta

Thalassemia beta diakibatkan oleh insufisiensi (β+) atau tidak adanya produksi (β0) dari rantai globin beta. Penyebabnya adalah mutasi gen globin beta. Gambaran yang ditemukan adalah anemia mulai dari ringan hingga berat tergantung pada derajat thalassemia beta yang terjadi.[3]

Thalassemia Alfa

Thalassemia alfa disebabkan oleh defek sintesis rantai globin alfa. Pada level molekular, hal ini disebabkan oleh terhapusnya gen globin alfa secara parsial (α+) atau total (α0), atau yang lebih langka disebabkan oleh mutasi dari satu atau lebih dari empat rantai globin alfa (αα/αα).[3]

Penyakit Sel Sabit

Pasien dengan penyakit sel sabit manifestasi klinis yang terjadi bergantung pada seberapa banyak jumlah HbS. Gejala dapat mulai muncul sebelum usia satu tahun, dengan anemia hemolitik kronik dan gangguan tumbuh kembang.masalah utama yang dikeluhkan adalah krisis nyeri yang dapat terjadi di punggung, ekstremitas, toraks, abdomen dan sistem saraf pusat.[3,6]

Pemeriksaan Penunjang

Pemeriksaan penunjang untuk mendiagnosis dan mendeteksi dini hemoglobinopati telah berkembang dan tidak lagi hanya bergantung pada metode elektroforesis terutama setelah negara maju seperti di negara Barat melakukan skrining genetik hemoglobinopati secara menyeluruh untuk setiap neonatus yang lahir di negara mereka.[1]

Hitung Darah Lengkap

Hitung darah lengkap sangat penting sebagai skrining hemoglobinopati terutama sindrom thalassemia. Petunjuk utama yang dapat dijadikan acuan adalah nilai MCV (mean corpuscular volume) atau MCH (mean corpuscular haemoglobin) yang rendah. Karena defisiensi besi juga dapat menjelaskan rendahnya nilai MCV atau MCH pada suatu keadaan anemia, perlu pula dilakukan penapisan defisiensi besi pada pasien.[7,13]

Isoelectric Focusing (IEF)

Metode ini bekerja dengan memisahkan protein dalam medium gel yang memiliki derajat perbedaan pH yang terdiri dari ampholytes (zwitterions). Ketika diberikan voltase daya tinggi, zona buffer sempit yang stabil terbentuk berdasarkan derajat perbedaan pH. Hemoglobin akan bermigrasi kedalam zona dengan medium pH yang sesuai dengan individual isoelectric points (pI). Kemudian gambaran pola zona migrasi dibaca dan disesuaikan dengan kontrol IEF.[1]

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Metode HPLC merupakan metode yang bertujuan untuk memisahkan suatu senyawa atau molekul berdasarkan karakteristik kimianya. Hemoglobins dipisahkan oleh analytical cartridge didalam kation HPLC menggunakan buffer gradient yang telah diprogram sebelumnya dengan meningkatkan kekuatan ionik pada cartridge. Fraksi hemoglobin terpisah berdasarkan interaksi ioniknya dengan cartridge. fraksi yang terpisah kemudian melewati flow cell, dengan mengukur tingkat absorbsi  pada 415 nm dan 690 nm untuk mengurangi background noise.[1,13]

Perubahan tingkat absorbansi dipantau tiap waktu membentuk suatu chromatogram (absorbance vs. time). Setiap hemoglobin memiliki karakteristik waktu retensi yang khas dan diukur mulai dari saat injeksi sampel ke dalam HPLC hingga mencapai titik puncak absorbansi.[1]

Cellulose Acetate Electrophoresis (Alkaline)

Cellulose Acetate Electrophoresis atau alkaline electrophoresis memanfaatkan negative charge pada hemoglobin bila berada pada kondisi alkali. Sampel diletakan pada gel agar asetat selulosa dan molekul hemoglobin dipisahkan melalui metode elektroforesis dengan buffer alkaline seperti Tris-EDTA dengan asam borat pada pH 8.4.[1]

Setiap varian hemoglobin memiliki net charge yang berbeda-beda sehingga memiliki kecepatan migrasi yang berbeda pula. Bersama migrasi elektroforesis, akan tampak gambaran hemoglobin bands dengan pewarnaan Ponceau S, Amino Black dan Acid Violet atau pewarna serupa lainnya dan kemudian dibandingkan dengan standar baku.[1]

Citrate Agar Electrophoresis (Acid)

Elektroforesis dilakukan dalam suasana asam dengan pH 6.2. metode ini berdasarkan interaksi kompleks antara hemoglobin  dengan buffer elektroforesis dengan bantuan Agar. Pewarnaan membantu visualisasi hemoglobin bands. Acid electrophoresis dapat membantu mengkonfirmasi varian hemoglobins yang ditemukan pada pemeriksaan Cellulose Acetate Electrophoresis dan dapat membedakan dengan baik antara HbC dan HbE serta HbO-Arab. Metode ini juga dapat membedakan HbS dari HbD dan HbG. Citrate Agar electrophoresis lebih sensitif dibanding Cellulose acetate dalam mendeteksi HbF.[1]

Metode Molekuler

Metode pemeriksaan molekular untuk hemoglobinopati umumnya menggunakan tiga Teknik, yaitu Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Allelic Discrimination using Real Time PCR end point data dan DNA Sequencing.[1]

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP):

RFLP memanfaatkan recognition sequences of restriction enzymes yang dapat menggambarkan normal allele atau mutasi alel dari sebuah gen. jika recognition sequence didapatkan,enzim restriksi akan memotong DNA dan perbedaan ukuran ini dapat divisualisasikan dengan gel electrophoresis.[1]

Allelic Discrimination using Real-time PCR:

Allelic Discrimination (AD) mengukur fluoresensi diakhir PCR (Polymeric Chain Reaction)untuk menentukan ada tidaknya mutasi gen. setelah DNA berhasil diekstrak dari sampel, dilakukan forward and reverse PCR primers, DNA polymerase, nucleotide triphosphates, (dNTPs) dan dua probes dipersiapkan. Satu probe mewakili untai normal dan yang lainnya mewakili untaian mutan. fluorophor yang berikatan dengan tiap primer memperlihatkan fluoresensi dengan Panjang gelombang yang berbeda beda.[1]

DNA Sequencing:

Sanger sequencing adalah metode yang paling menyeluruh untuk mendeteksi adanya mutasi genetic dan menetukan untai yang digunakan sebagai primers. Setelah DNA diekstrak dari sampel, kemudian diamplifikasi dengan PCR tetapi dengan penambahan DNA polymerase dan dNTPs, dideoxynucleotides (ddNTPs). Setiap empat ddNTPs berikatan dengan fluorophor spesifik, yang memancarkan sinyal dengan Panjang gelombang yang berbeda-beda. Kemudian informasi ini dianalisis dengan instrumen software dan untaian kemudian dapat divisualisasikan.[1,7]

Deskripsi Penyakit Hemoglobinopati

Hemoglobinopati merupakan istilah umum yang digunakan untuk menunjukkan kelompok penyakit genetik pada hemoglobin. Hemoglobinopati dibagi menjadi dua kelompok besar yaitu [3,5]:

• Sindrom Thalassemia

• Varian struktur abnormal Hemoglobin

Kedua kelompok besar ini sama-sama disebabkan oleh mutasi dan atau terhapusnya gen globin alfa atau beta. Ketika defek genetik menyebabkan gangguan sintesis Hb, defek ini menyebabkan timbulnya Thalassemia. Struktur Hemoglobin pada kasus tersebut normal.[3]

Ketika defek genetik menyebabkan terjadinya perubahan struktur Hb, kemudian penyakit ini digolongkan kedalam abnormal hemoglobin. Selain itu ada juga bentuk campuran dari kedua kelompok besar ini.contohnya adalah β0/β+-thalassemias, HbSC disease dan HbE α-thalassemias.[3]