Patofisiologi intoleransi laktosa diawali oleh terjadinya defisiensi enzim laktase. Laktase merupakan enzim yang terdapat di brush border vili usus halus, yang berfungsi untuk menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa sehingga dapat diabsorbsi oleh saluran pencernaan. Kadar laktase tertinggi ditemukan pada saat lahir, kemudian mengalami penurunan hingga jumlahnya kurang dari 10% pada saat masa anak-anak. Laktosa dapat ditemukan pada susu mamalia atau dairy product, dan merupakan sumber karbohidrat terbesar pada masa bayi. Konsentrasi laktosa pada air susu ibu (ASI) sebesar 7.2 mg per 100 ml, dan pada susu sapi sebesar 4.7 mg per 100 ml.[1,3,6]

Defisiensi laktase menyebabkan laktosa tidak dapat dipecah menjadi glukosa dan galaktosa sehingga tidak dapat diabsorpsi oleh saluran pencernaan. Laktosa yang tidak terabsorbsi selanjutnya difermentasi oleh bakteri di kolon, menghasilkan asam lemak rantai pendek dan gas (karbon dioksida, hidrogen, dan metan). Gas yang dihasilkan menyebabkan gejala nyeri abdomen dan bloating.[2,4,6]

Laktosa yang tidak diabsorbsi dalam usus halus menyebabkan adanya perbedaan tekanan osmotik dan menyebabkan tertariknya air ke dalam lumen usus sehingga menyebabkan munculnya gejala diare.[2,4,6]